Cell | 揭示原始内胚层多能性：重塑胚胎发育的新途径

长安城，等故人

在哺乳动物的早期胚胎发育过程中，囊胚的形成涉及外胚层（trophectoderm，TE）的特化，随后内细胞团（inner cell mass，ICM）分化为胚胎上皮细胞（epiblast，Epi）和原始内胚层（primitive endoderm，PrE）。这一过程中，胚胎保持了一段时间的多能性（plasticity），即在实验条件下，细胞能够重新定位其命运。6月24日Cell杂志的报道“The primitive endoderm supports lineage plasticity to enable regulative development        ”，发现单独的PrE细胞就足以再生出完整的囊胚，并继续植入后的发育。
研究人员在体外鉴定了一种与早期PrE相似的细胞群体，这些细胞群体展示了相同的胚胎和胚外的多能性，能够形成完整的干细胞模型——称为胚样体（blastoids）。PrE细胞的分化受JAK/STAT信号通路的抑制，同时OCT4的持续表达以及一部分多能性相关转录因子的表达，维持了一种允许多谱系分化的增强子（enhancer）景观。
该研究表明，转录因子的持续存在是调控发育中多能性的基础，并强调了PrE在受干扰发育中的重要性。该研究为理解胚胎早期发育中的细胞多能性机制提供了新的见解，并揭示了PrE在再生胚胎发育过程中的关键作用。
这些发现不仅挑战了传统观点，即PrE只是简单的支持组织，还表明它在胚胎发育的调节性过程中发挥了重要作用。通过深入研究PrE的分子基础和其在多能性维持中的作用，可以更好地理解胚胎发育的复杂性及其潜在的应用前景。

在哺乳动物胚胎发育的早期阶段，胚胎细胞的命运并非一成不变。2细胞阶段的胚胎细胞（blastomere）能够从单个细胞生成一个完整的有机体，随着发育的进行，每个胚胎细胞的潜能逐渐受到限制。胚胎在囊胚形成阶段，ICM中的细胞在成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）的作用下，分化为Epi或PrE。Epi最终发育成胚胎本身，而PrE则发育成视网膜内胚层（visceral endoderm，VE）和壁内胚层（parietal endoderm，PE）。
为了探索原始内胚层（primitive endoderm, PrE）在哺乳动物早期胚胎发育中的多能性（plasticity），研究人员进行了多项关键实验。这些实验不仅帮助我们理解PrE的特性，还揭示了其在胚胎发育过程中的调控机制。
胚胎处理
研究人员将8细胞阶段的胚胎分成两组，分别用成纤维细胞生长因子4（FGF4）和MEK抑制剂PD0329501（PD03）处理24小时，以转化为PrE或Epi。处理后，通过免疫手术去除外胚层（trophectoderm, TE），并在不同条件下培养这些胚胎。
细胞标记和确认
使用GATA6和NANOG作为PrE和Epi细胞的标记物，分别确认处理后的内细胞团（inner cell mass, ICM）细胞类型。通过免疫荧光染色和细胞计数，评估不同处理条件下ICM中PrE和Epi细胞的比例。
体外培养和验证
从小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）分化得到PrE细胞，然后在含有白血病抑制因子（LIF）、Wnt和转化生长因子β（TGF-β）信号的培养基中扩展为原始额外胚层干细胞（naive extra-embryonic endoderm, nEnd）。在三维培养条件下，观察nEnd细胞自发形成具有内外层结构的球体，外层为GATA6阳性细胞，内层为SOX2阳性细胞。

在FGF4和PD03处理下，PrE细胞和Epi细胞的多能性和再生能力（Credit: Cell）
实验处理和设计：通过将8细胞阶段的小鼠胚胎分别用成纤维细胞生长因子4（FGF4）和MEK抑制剂PD0329501（PD03）处理24小时，将其分别转化为原始内胚层（primitive endoderm, PrE）或胚胎上皮细胞（epiblast, Epi）。处理后，通过免疫手术去除外胚层（trophectoderm, TE），并在不同条件下培养这些胚胎。
PrE的多能性和再生能力：在去除TE后，单独的PrE细胞能够再生出完整的囊胚。这些再生出的囊胚包含了TE、Epi和PrE细胞。经过FGF4处理的胚胎中，76.9%的胚胎完全表达GATA6，而没有NANOG表达。这表明这些胚胎转化为PrE。再生后的胚胎在恢复48小时后，有79.2%的对照胚胎和63.6%的FGF4处理胚胎能够重建TE。在PD03处理的胚胎中，81.2%的胚胎完全表达NANOG，没有GATA6表达。这表明这些胚胎转化为Epi。然而，只有29%的PD03处理胚胎能够重建TE。
细胞命运追踪：使用转基因小鼠模型，通过Cre-loxP系统特异性标记和追踪PrE细胞，发现PrE细胞能够再生TE和Epi细胞。在这些实验中，重新构建的囊胚中，CDX2和NANOG与mGFP共表达，表明先前表达PDGFRA的PrE细胞转换为Epi或TE细胞。
细胞命运决定的实验验证：在进一步的实验中，通过在体外条件下释放FGF4刺激，PrE细胞能够在完整TE的背景下生成Epi细胞。大多数（89%）胚胎在处理后包含NANOG阳性细胞，表明PrE细胞具有生成Epi的能力。使用Pdgfra-CreERT2和Rosa26mT/mG小鼠模型，经过FGF4处理和4OHT诱导后，E4.5阶段的胚胎中包含NANOG和mGFP共表达细胞，进一步确认了PrE细胞的多能性。
功能性验证：将成功重建的FGF4处理和对照胚胎移植到假孕小鼠中，发现重新构建的胚胎能够支持正常发育，表达Epi、VE/PE和胚外外胚层（extra-embryonic ectoderm）的标记物。
PrE细胞的多能性
PrE再生囊胚：研究发现，在去除TE后，单独的PrE细胞能够再生出完整的囊胚。经过FGF4处理的胚胎中，76.9%的胚胎完全表达GATA6，而没有NANOG表达，这表明这些胚胎转化为PrE。
再生TE和Epi：经过进一步培养，这些PrE胚胎能够再生出TE和Epi细胞，表明PrE细胞具有强大的多能性。在移植实验中，PrE细胞能够形成正常发育的胚胎，进一步验证了其多能性。
增强子景观的调控
OCT4维持多能性：在体外培养的nEnd细胞中，OCT4的持续表达维持了细胞的多能性。使用带有OCT4-mCherry报告基因的细胞系，通过流式细胞术分选出PDGFRA-APC阳性细胞、双阳性细胞（PDGFRA-APC/OCT4-mCherry）和OCT4-mCherry单阳性细胞，观察到双阳性细胞能够生成TE和Epi样细胞。
JAK/STAT信号通路：通过阻断JAK/STAT信号通路，发现去除该信号会导致多能性细胞减少，而单阳性细胞比例增加，表明JAK/STAT信号在维持多能性过程中起关键作用。
体外模型验证
nEnd细胞形成3D球体：在三维培养条件下，nEnd细胞能够自发形成具有内外层结构的球体，外层为GATA6阳性细胞，内层为SOX2阳性细胞，模拟了胚胎早期的分化状态。这些球体的形成效率高达61.3%。

模式图（Credit: Cell）
原始内胚层（PrE）在哺乳动物胚胎发育中的多能性和调控能力为我们提供了一个理解细胞命运决定和发育调控的独特模型。通过对PrE细胞的研究，研究人员不仅揭示了其在胚胎发育中的关键作用，还为再生医学和发育生物学的研究提供了新的方向和思路。未来的研究可以进一步探讨PrE细胞在不同生理和病理条件下的行为，以及如何利用这些细胞进行疾病治疗和再生医学应用。这一研究不仅挑战了传统观点，即PrE只是简单的支持组织，还表明它在胚胎发育的调控性过程中发挥了重要作用。通过深入研究PrE的分子基础和其在多能性维持中的作用，可以更好地理解胚胎发育的复杂性及其潜在的应用前景。

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